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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 860 (2023) Citar este artículo

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Investigamos la desintoxicación mediada por lacasa de aflatoxinas, contaminantes alimentarios cancerígenos fúngicos. Nuestra comparación experimental entre dos aflatoxinas con estructuras similares (AFB1 y AFG2) muestra diferencias significativas en la desintoxicación mediada por lacasa. Un enfoque de modelado multiescala (docking, dinámica molecular y teoría funcional de la densidad) identifica los cambios altamente específicos del sustrato necesarios para mejorar el rendimiento de desintoxicación de lacasa. Empleamos un enfoque basado en la teoría funcional de densidad a gran escala, que involucra más de 7000 átomos, para identificar los residuos de aminoácidos que determinan la afinidad de la lacasa por las aflatoxinas. A partir de este estudio concluimos: (1) AFB1 es más difícil de degradar, hasta el punto de detenerse por completo la degradación; (2) AFG2 es más fácil de degradar por lacasa debido a su falta de productos secundarios y dinámica de unión favorable; y (3) existen amplias oportunidades para optimizar la lacasa para la degradación de aflatoxinas, especialmente a través de mutaciones que conducen al apilamiento π–π. Este estudio identifica una forma de optimizar la lacasa para la biorremediación de aflatoxinas y, de manera más general, contribuye a los esfuerzos de investigación destinados a la optimización racional de enzimas.

Las aflatoxinas son metabolitos secundarios de hongos peligrosos que contaminan regularmente cultivos como el maíz, el arroz, el trigo y el maní1. Las aflatoxinas son producidas por el género fúngico Aspergillus y se encuentran entre los contaminantes naturales más cancerígenos2. La contaminación por aflatoxinas es un importante problema de seguridad alimentaria. Existen estrategias de desintoxicación física y química, pero pueden tener un impacto negativo en la calidad de los alimentos y ser costosas, poco confiables o inseguras3,4. En un esfuerzo por desarrollar alternativas más seguras, se ha propuesto la recuperación de alimentos a través de enzimas amigables con el medio ambiente5. Para ello, se identificó a la lacasa como un buen candidato6,7,8.

La lacasa es una enzima de interés general en biotecnología9,10. Es una oxidasa multicobre monomérica que cataliza oxidaciones de un electrón junto con la reducción total del oxígeno molecular a agua. El sitio activo consta de tres sitios de unión de cobre con diferentes propiedades espectroscópicas y funcionales. El cobre azul tipo 1 es el aceptor de electrones del sustrato; el grupo trinuclear formado por cobre tipo 2 y cobre binuclear tipo 3 es el sitio de unión y reducción de oxígeno11. La lacasa es taxonómicamente ubicua12 y funcionalmente versátil: su amplia tolerancia al sustrato la hace relevante para aplicaciones industriales9. Entre las variantes naturales, las lacasas fúngicas tienen el mayor potencial redox (E°), hasta 800 mV, en el tipo 1 de cobre12. Varios informes existentes ya han identificado lacasas bacterianas y fúngicas que interactúan con las aflatoxinas6,13,14,15,16,17; sin embargo, incluso las isoformas más activas carecen de eficiencia de tiempo/costo para satisfacer las demandas actuales de desintoxicación de aflatoxinas en la industria de alimentos y piensos. Investigaciones anteriores se han centrado en la optimización de lacasa, para diferentes funciones, mediante diseño racional o evolución dirigida18,19,20. En el contexto específico de la degradación de las aflatoxinas, el acoplamiento molecular ha proporcionado conocimientos mecánicos21, el análisis de estructuras en 3D de diferentes isoformas evaluó la interacción con las aflatoxinas7 y el análisis mutacional exploró cambios beneficiosos22.

En este trabajo, combinamos enfoques experimentales y computacionales para allanar el camino hacia una optimización racional de lacasa como biorremediador de aflatoxinas con un enfoque en la aflatoxina B1 (AFB1), el congénere más cancerígeno. Empleamos lacasa de Trametes versicolor (TV), una especie de hongo cuyo nicho ecológico se adapta a la degradación de la lignina mediada por lacasa23. Realizamos un análisis en profundidad de la desintoxicación de la principal molécula objetivo, AFB1, por TV lacasa para identificar los mecanismos detrás de los cuellos de botella de la reacción. Nuestros datos también incluyen experimentos con un congénere AFB1, la aflatoxina G2 (AFG2). Al resaltar las notables diferencias en la actividad de la lacasa en AFB1 y AFG2, a pesar de su similitud estructural, implicamos que la mejora de la afinidad no se puede lograr al especializar la enzima hacia una categoría general de compuestos (por ejemplo, hidrocarburos, estructuras aromáticas no fenólicas o incluso aflatoxinas como categoría). ). Por lo tanto, realizamos una caracterización mecánica cuántica (QM) extensa y de alto detalle en toda la estructura de lacasa de TV unida a AFB1 y AFG2, incluidos aproximadamente 7000 átomos. Predecimos que los residuos de aminoácidos individuales específicos no serán óptimos para la degradación de aflatoxinas y proponemos los cambios estructurales relacionados para abordar los cuellos de botella de la reacción.

Primero construimos un modelo fenomenológico preliminar basado en la actividad de lacasa in vitro sobre las aflatoxinas. El modelo destaca dos puntos principales: (i) la eficacia de la lacasa contra la aflatoxina no está limitada por el potencial redox de su sitio activo, sino por la escasa afinidad por la aflatoxina como sustrato; (ii) AFB1, a diferencia de AFG2, se desvía de la cinética establecida de Michaelis-Menten característica de la actividad de lacasa24. Luego realizamos un análisis teórico de las dos aflatoxinas que revela el origen de estas diferencias. Finalmente, analizamos computacionalmente los sistemas completos de lacasa-aflatoxina para comprender qué residuos contribuyen a la unión y cómo.

En la estructura química de las aflatoxinas, el anillo de lactona es responsable tanto de la toxicidad25 como de la fluorescencia natural de la molécula. Como resultado, la concentración y la toxicidad de las aflatoxinas pueden analizarse fluorimétricamente. En este trabajo, definiremos la desintoxicación como una reacción que rompe el anillo de lactona en la estructura aromática de la aflatoxina, lo que provoca la pérdida de la fluorescencia natural y la toxicidad. Este ensayo se puede utilizar tanto para AFB1 como para AFG2 (consulte la sección "Métodos").

Evaluamos la actividad de desintoxicación de la lacasa de TV a diferentes concentraciones iniciales de AFB1 y AFG2. El ensayo fluorimétrico destaca dos tendencias distintas de desintoxicación para AFB1 frente a AFG2. La lectura de fluorescencia de AFB1 sigue una tendencia decreciente que, después de aproximadamente 10 h, cambia a una tendencia más lenta. En general, la desintoxicación durante 96 horas asciende a aproximadamente el 12% de la cantidad original de la toxina (Fig. 1A). La desintoxicación de AFG2, por el contrario, muestra una tendencia constante, lo que lleva a su finalización dentro de las 96 h (Fig. 1B). Es importante destacar que, en ausencia de lacasa, se observó poca desintoxicación de AFB1 y AFG2 (Fig. S1).

La desintoxicación de AFB1 y AFG2 por lacasa destaca la diferencia en la eficiencia de desintoxicación incluso entre aflatoxinas con estructura similar. Se emplearon diferentes concentraciones iniciales de aflatoxina y están representadas para AFB1 (A) y AFG2 (B). Cada curva es el promedio de 3 repeticiones. Un subconjunto de puntos de (A,B) se selecciona aleatoriamente y se representa en (C,D) para calcular las tasas locales de desintoxicación normalizadas \(\left(\frac{-1}{\left[L\right]}\frac {d\izquierda[T\derecha]}{dt}\derecha)\). Aquí, \(\left[T\right]\) es la concentración de toxina y \(\left[L\right]\) es la concentración de lacasa. Eficiencia de desintoxicación \(\left(\eta \stackrel{\scriptscriptstyle\mathrm{def}}{=}\frac{-1}{\left[L\right]\left[T\right]}\frac{\Delta \left[T\right]}{\Delta t}\right)\) de AFB1 (C) es casi un orden de magnitud menor que el de y AFG2 (D) en concentraciones comparables. Las líneas punteadas en (C,D) ilustran la predicción del modelo. La dirección del tiempo se representa en (C,D) para resaltar la disminución en la concentración de toxinas como resultado de la desintoxicación. Concentración de lacasa: 25 U/mL.

Para inferir la actividad enzimática de la lacasa contra las aflatoxinas, asumimos que la desintoxicación por lacasa sigue la cinética de Michaelis-Menten. Luego ajustamos un modelo fenomenológico a nuestros datos experimentales (consulte la sección "Métodos"). Para probar si la concentración de toxina es mucho más baja que la constante de Michaelis-Menten (\({K}_{m}\gg \left[T\right]\)), en los datos experimentales definimos la eficiencia de desintoxicación como \( \eta \stackrel{\scriptscriptstyle\mathrm{def}}{=}\frac{-1}{\left[L\right]\left[T\right]}\frac{\Delta \left[T\right] }{\Delta t}\) (en \(\mathrm{mL}/(U\cdot \mathrm{h})\)) donde \(\Delta \left[T\right]\) es el cambio en el concentración de toxina en un pequeño paso de tiempo \(\Delta t\). Dado que \(\eta =\frac{\rho }{[T]}\) parece ser constante en la degradación temprana (es decir, una tendencia lineal en la Fig. 1C,D), confirmamos que \({K}_{m }\gg \left[T\right]\) es una aproximación válida. Cálculo de la cinética de desintoxicación de la ecuación. (3), y utilizando el valor de \(\eta\) estimado a partir de datos experimentales, el modelo se aproxima con precisión a la cinética medida en el caso de AFG2 a lo largo del tiempo experimental (Fig. 1D), lo que confirma aún más que este modelo es adecuado para que representa la desintoxicación de aflatoxinas por lacasa. Sin embargo, AFB1 se adhiere a la cinética de Michaelis-Menten solo por un corto tiempo antes de entrar en una dinámica de desintoxicación más lenta, no similar a Michaelis-Menten (Fig. 1C). Por lo tanto, en comparación con AFG2 y otros sustratos conocidos de lacasa, AFB1 muestra una tendencia poco característica.

El hallazgo de que, a concentraciones relevantes de la toxina, obtenemos \({K}_{m}\gg \left[T\right]\) puede interpretarse como una actividad relativamente pobre de la lacasa para degradar la toxina. Consideramos la asociación y la actividad enzimática en la vista estándar26:

donde D es la toxina detoxificada, y \({K}_{m}=\frac{{k}_{2}+{k}_{-1}}{{k}_{1}}\gg \ left[T\right]\) significa \({k}_{2}+{k}_{-1}\gg {k}_{1}\left[T\right]\). Esto puede interpretarse como una baja afinidad de la enzima por la aflatoxina, tanto AFB1 como AFG2, ya que la tasa de asociación es mucho menor que las tasas de degradación/disociación. Esta baja afinidad sugiere que la lacasa no está naturalmente bien adaptada para desintoxicar la aflatoxina. De hecho, se ha reportado27 que bajo condiciones optimizadas (tampón citrato 0.1 M pH 4.5, DMSO 20% 35 °C, TV lacasa 30 U/mL) la Km para AFB1 fue 0.28 mM y la tasa de degradación con 80 μg/ mL AFB1 fue kL = 0,89 μg/(U·día). Esto corresponde a una eficiencia de desintoxicación de \(\eta =4\times {10}^{-4}\) mL/(U·h) que es comparable a nuestros resultados informados en la Fig. 1C.

Para comprender las diferencias observadas entre AFB1 y AFG2, investigamos las propiedades de estas moléculas utilizando un modelo QM en fase gas y Conceptual DFT28 (ver la sección "Métodos"). Primero, usamos ΔSCF para calcular los potenciales de ionización de las dos moléculas. Para AFB1 el valor es de 7,3 eV y para AFG2 es de 7,5 eV. Por lo tanto, las dos moléculas parecen igualmente fáciles de oxidar, desde una perspectiva energética. Además, utilizamos los resultados de los cálculos de ΔSCF para generar isosuperficies de FuF que resaltan los sitios susceptibles de una oxidación hipotética de un electrón (Fig. 2). Una diferencia significativa entre las dos isosuperficies es la presencia de un sitio de oxidación en el anillo de furano de AFB1, que difiere de AFG2 en que tiene un doble enlace. Esto sugiere que hay un sitio reactivo diferente de AFB1 que está lejos del anillo de lactona.

Las isosuperficies de las funciones de Fukui de AFB1 y AFG2 en la fase gaseosa indican los sitios propensos a la oxidación. Isosuperficies de Fukui: rojo (−) y azul (+). Nivel de isosuperficie de ± 0,003 Å−3.

En el modelo QM, vemos que el anillo de lactona no se abre espontáneamente después de la oxidación de la toxina sin una estimulación ambiental posterior, como un radical de hidrógeno. Se requiere un proceso de varios pasos para realizar la apertura del anillo, que se refleja en el FuF, donde vemos que es poco probable que el electrón se tome directamente del anillo de lactona (particularmente en el caso de AFB1). Si dicha estimulación ambiental se localiza en la proximidad inmediata del anillo de lactona, el reordenamiento estructural termina espontáneamente en la apertura del anillo (Figura complementaria S4). AFG2 exhibe una conformación de energía libre más baja después de la ruptura del anillo (−1,71 eV en comparación con el estado oxidado), en comparación con AFB1 (−1,34 eV en comparación con el estado oxidado), lo que sugiere una mayor tendencia hacia esta transición. Sin embargo, como se señaló anteriormente, la afinidad de degradación por sí sola no puede describir la diferencia en la dinámica entre las dos toxinas.

Se realizó un análisis LC-MS para investigar los productos de degradación (Figuras complementarias S2, S3). Tanto para AFB1 como para AFG2 se encontró un producto con el anillo abierto que coincide con la observación de fluorescencia reducida (Fig. 3, incluido el mecanismo propuesto). Para AFB1, otros productos de oxidación incluyen las conocidas formas epoxi y dihidroxiladas en el anillo de furano terminal (Figs. S2, S3 complementarias). No se encontró una forma epoxi de AFG2, lo cual es consistente con nuestro modelo QM que sugirió que el anillo de furano de AFB1 es más reactivo. Esta forma de epoxi todavía emitiría fluorescencia y, por lo tanto, puede representar una reacción secundaria importante que no da como resultado una desintoxicación exitosa. El mecanismo que proponemos es coherente con la amoníación de AFB1 para producir AFD1 a través de la ruptura del anillo de lactona, discutido en trabajos previos25,29,30.

Los principales productos de reacción de AFB1 y AFG2 se descomponen, identificados por LC-MS y vías de reacción hipotéticas. Los principales mecanismos propuestos son la apertura del anillo de lactona y la formación de epóxido.

Nuestra evidencia experimental ha demostrado que la TV lacasa tiene una afinidad insuficiente por las aflatoxinas AFB1 y AFG2. Para comprender la unión observada, utilizamos Docking and Molecular Dynamics (MD) para generar un conjunto diverso de poses, que luego podemos calificar mediante cálculos DFT (Fig. 4). En general, vemos poca diferencia en las energías de unión entre AFB1 y AFG2, lo que nuevamente respalda que la energía por sí sola no puede explicar la discrepancia en la dinámica entre las dos toxinas. Para AFG2, una pose (G-10-0) emerge como significativamente más baja en energía (Figura complementaria S5). Observamos que AFG2 permanece en esta pose durante la duración de esa trayectoria.

Las energías de interacción de diferentes poses de AFB1 y AFG2 extraídas de una simulación MD utilizando un modelo de grupo no muestran diferencias importantes entre los congéneres. Las energías se muestran para dos modelos QM diferentes (PBE + D3 y B97M-V).

Para AFB1, hay dos posturas de baja energía que compiten (B1-2-2 y B1-15-2), y la última permanece en una posición de unión fuerte durante más tiempo. Observamos que si bien AFB1 puede oxidarse en la posición B1-2-2, es poco probable que el anillo se abra, porque el sitio reactivo del anillo de lactona está enterrado profundamente en el bolsillo (Fig. S5 complementaria). Desde una perspectiva puramente geométrica, también vemos que el anillo de furano de AFG2 está muy adentro del bolsillo, mientras que este sitio está expuesto al solvente para las poses de baja energía de AFB1. Encontramos una pose adicional de AFB1 (B1-1-0) que tiene el anillo de furano dentro del bolsillo, aunque tiene una energía de interacción más débil que otras poses de AFB1.

En la Fig. 5, mostramos un mapa de calor de las interacciones aminoácido-toxina definidas por la medida FBO. Las visualizaciones de estas interacciones están disponibles en la figura complementaria S6. Para la única pose de AFG2 de baja energía, se forma una fuerte interacción basada en un enlace de hidrógeno entre Thr430 y el oxígeno doblemente unido del anillo de lactona. Estudios anteriores han llamado la atención sobre el papel de Asn206 e His458 (el ligando del cobre azul tipo 1) en la transferencia de carga en lacasa, con His458 participando en la transferencia de carga y Asn206 desempeñando un papel en el reconocimiento del sustrato; se ha sugerido que se requiere una distancia de menos de 5 Å para una degradación eficiente31,32. Para G2-10-0, el oxígeno del anillo de furano está dentro de los 2,5 Å de His458 (y la toxina está a 2,8 Å de Asp206), y se mantiene allí por una interacción con el vecino Gly392. Para la pose B1-1-0 de AFB1 (la pose más similar a G2-10-0), existe una interacción similar con Thr430 y se complementa con una interacción con Leu164. En esta pose, el oxígeno del anillo de furano está mucho más lejos de His458 (4,4 Å), aunque la toxina está a una distancia similar a Asp206 (2,5 Å).

El mapa de calor de las interacciones entre los residuos de lacasa y las poses de toxinas de baja energía medidas por FBO resalta los residuos de interés. Un FBO más alto indica una interacción más fuerte.

Para B1-2-2, observamos que el anillo de lactona está profundamente enterrado en el bolsillo, siendo la distancia entre el oxígeno con doble enlace del anillo de cinco miembros y His458 de 2,4 Å. La interacción principal es entre Asn264 y los anillos de furano en el lado opuesto. B1-2-2 también interactúa con Pro394, que está cerca de His458 y está dentro de 2,9 Å para Asp206. Con B1-15-2, Thr430 vuelve a ser una interacción importante, así como Ala389 y Ala432. B1-15-2 está cerca de Asp206 (2,4 Å), pero lejos de His458; el grupo metilo está dentro de los 5,4 Å y el oxígeno más cercano (de un grupo furano) está a 6,6 Å de distancia (las distancias son similares para las otras instantáneas de la trayectoria B1-15). Si bien la interacción con la enzima es fuerte, es probable que esta posición sea pobre para la oxidación. Notamos que la única interacción aromática significativa detectada en estas poses de baja energía por nuestro análisis involucra a Phe265. Este residuo interactúa con el anillo de furano de B1-1-0 y G2-10-0, y no con sus grupos aromáticos. Esto sugiere que existe una gran oportunidad para optimizar las interacciones de TV lacasa con AFB1 y AFG2 mediante la explotación del apilamiento π–π.

La contaminación por aflatoxinas es una preocupación importante entre los problemas de seguridad alimentaria, y la desintoxicación mediada por lacasa se considera un enfoque de biorremediación "verde" prometedor12. La evolución de esta enzima que degrada la lignina ha dado lugar a un sitio activo con el mayor potencial redox entre las oxidasas multicobre9. Tal potencial oxidativo poco común es un activo necesario para descomponer las fracciones aromáticas de las aflatoxinas. Sin embargo, como destacan nuestros datos, la lacasa carece de una alta afinidad hacia AFB1 y, por lo tanto, está naturalmente lejos de estar optimizada para llevar a cabo esta reacción. Para que la biorremediación tenga una oportunidad realista de implementarse de manera consistente, debe incorporarse sin problemas durante el proceso actual de producción de alimentos. Con esto en mente, el mejor contexto para la biorremediación de aflatoxinas mediada por lacasa es durante el paso de lavado convencional con agua en el proceso de producción de productos alimenticios. Para eso, la desintoxicación de AFB1 debe lograrse en no más de 3 h, en un ambiente ligeramente ácido (pH de 6.5), aeróbico, líquido a temperatura ambiente. Nuestros datos indican que, a pH 6,5, incluso la desintoxicación de AFG2 por TV lacasa tarda más de 48 h, muy lejos de lo que sería prácticamente necesario. Por lo tanto, la lacasa como biorremediador de aflatoxinas realista requiere una optimización sustancial.

Usando una combinación de modelos teóricos experimentales y multiescala, encontramos que el ajuste específico del sustrato de alto detalle es obligatorio para la aplicación en aflatoxinas. Dicho ajuste deberá seguir un enfoque diferente incluso a los mejores esfuerzos de acoplamiento molecular (por ejemplo, Refs.33,34,35). Si bien se ha demostrado que con un conjunto suficiente de descriptores de las simulaciones de acoplamiento y MD, junto con el modelado QM del sustrato en fase gaseosa32, es posible predecir la afinidad de lacasa en una amplia clase de sistemas, las diferencias dramáticas en la dinámica entre los dos estructuras similares estudiadas en este trabajo muestran la limitación de una caracterización más amplia. Con este fin, hemos utilizado un enfoque QM a gran escala para identificar los aminoácidos relevantes involucrados en la unión de las posiciones de baja energía de las dos toxinas. Nuestros resultados sugieren que la eficiencia puede mejorarse optimizando la lacasa para una unión más fuerte a la aflatoxina, pero se debe tener cuidado con la orientación de unión específica que se está optimizando. Sugerimos que los experimentos de ajuste comiencen con el trabajo en AFG2, ya que mientras AFB1 es un objetivo de mayor importancia, la dinámica más simple de AFG2 proporcionará una señal más clara de un flujo de trabajo de optimización exitoso.

Todavía se necesita más investigación para dilucidar completamente las limitaciones de lacasa para la biorremediación de aflatoxinas. La lacasa es particularmente difícil de modelar, ya sea utilizando MD clásico o DFT, debido a la presencia de un metal de transición. El muestreo avanzado más sofisticado también puede revelar un conjunto más amplio de posibles poses vinculantes. En el futuro se debe realizar un estudio QM/MM completo del proceso de desintoxicación en el bolsillo de lacasa. Estos estudios de simulación pueden combinarse con más trabajo experimental, como la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y la dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS), que tienen la capacidad de sondear la estructura de la lacasa a una temperatura finita10,36. A pesar de estas limitaciones, nuestro estudio ha encontrado una fuerte evidencia de la necesidad de una optimización cuidadosa del bolsillo de lacasa y direcciones específicas para mejorar la eficacia. Para un proyecto de diseño tan racional, los residuos identificados en este estudio, junto con los conocimientos generales sobre el proceso de degradación presentados aquí, constituirán un buen punto de partida.

Suponemos que la lacasa desintoxica las aflatoxinas siguiendo la ecuación de Michaelis-Menten:

donde \(\left[T\right]\) es la concentración de toxina (en \(\frac{\mu \mathrm{g}}{\mathrm{mL}}\)), \(\left[L\ right]\) es la concentración de lacasa (en \(\mathrm{U}/\mathrm{mL}\)), \({K}_{m}\) es la constante de Michaelis-Menten (en \(\mu \mathrm{g}/\mathrm{mL}\)), y \({k}_{L}\) es la tasa de degradación por lacasa del estado asociado enzima-toxina (en \(\mu \mathrm{g }/(\mathrm{ml}\cdot \mathrm{h})\)). En el límite en que la concentración de toxina es mucho menor que la constante de Michaelis-Menten (\({K}_{m}\gg \left[T\right]\)), la ecuación se simplificará a

Definimos la eficiencia de desintoxicación como \(\eta \stackrel{\scriptscriptstyle\mathrm{def}}{=}\frac{-1}{\left[L\right]\left[T\right]}\frac{\ Delta \left[T\right]}{\Delta t}\approx \frac{{k}_{L}}{{K}_{m}}\) (en \(\mathrm{mL}/(\ mathrm{U}\cdot \mathrm{h}))\), que se puede calcular a partir de los datos experimentales. Aquí \(\Delta \left[T\right]\) es el cambio en la concentración de toxina en un pequeño paso de tiempo \(\Delta t\). Dado que podemos medir \(\left[T\right]\) experimentalmente a lo largo del tiempo, podemos calcular \(\eta\) así como la tasa de desintoxicación local normalizada \(\rho =\frac{-1}{\left [L\right]}\frac{d\left[T\right]}{dt}\). Cuando \(\eta =\frac{\rho }{[T]}\) es constante, podemos inferir que \({K}_{m}\gg \left[T\right]\).

Se disuelve lacasa de Trametes versicolor (Merck CAS80498) en tampón de acetato (pH 6,5) a una concentración final de 25 U/mL. La aflatoxina B1 y la aflatoxina G2 (Cayman Chemicals) se disuelven en metanol de grado LC-MS (Merck) en 4 concentraciones diferentes: 3, 30, 50, 100 μg/mL. Las soluciones tampón de lacasa y aflatoxinas se incuban a 28 °C, durante 96 h bajo el régimen de agitación continua rápida en un lector de microplacas multimodo Synergy™ Mx (Biotek); cada condición se realiza por triplicado. Debido a su fluorescencia natural, la concentración de aflatoxinas se mide fluorimétricamente (excitación a 380 nm y emisión a 440 nm; ganancia 65 y 50 para AFB1 y AFG2, respectivamente); las lecturas se adquieren cada 10 minutos, por un total de 577 al final del experimento. Los controles ensayan la fluorescencia de lacasa en el tampón en ausencia de aflatoxinas y la fluorescencia de AFB1 y AFG2 en ausencia de lacasa. Para convertir la lectura de fluorescencia a la concentración de toxina correspondiente, empleamos una curva de calibración basada en mediciones de un conjunto de concentraciones de toxinas conocidas (Fig. S1 complementaria).

La cinética de la reacción se simula en Matlab. Se emplea el método de mínimos cuadrados (lsqnonlin en Matlab) para ajustar la cinética de Michaelis-Menten a los datos experimentales. La eficacia de la desintoxicación se estima utilizando los datos de los primeros 100 minutos de cada experimento y encontrando el mejor ajuste lineal (sin intercepción) en función de la concentración inicial de toxina.

Se añadieron 25 U/mL de lacasa de Trametes versicolor (Sigma-Aldrich CAS80498) a 10 μg/mL de toxina, AFB1 o AFG2 (ambas de Cayman Chemicals) por separado, en tampón de acetato (100 mM, pH 6,5) y se dejó a 28 ° C durante 24 horas. Los productos de degradación se ensayaron en las siguientes condiciones: Columna: Kinetex 2,6 μm EVO C18; 100 × 2,1 mm; Fase móvil A: Agua Acetato de Amonio 5 mM, Ácido Acético al 0,5%; Fase móvil B: Metanol Acetato de amonio 5 mM, Ácido acético al 0,5%; Caudal: 350 μL/min; Longitud de onda ultravioleta: 354, 360 nm.

Se utilizó el siguiente método de gradiente en todas las ejecuciones. El eluyente de la columna se dirigió a la fuente de electropulverización de un espectrómetro de masas Agilent 6220 TOF operado en modo de ionización positiva. Los datos se convirtieron al formato de archivo mzML y se analizaron utilizando el software MZMine. Figs suplementarias. S2 y S3 muestran las trazas resultantes para AFB1 y AFG2, respectivamente. Los subproductos de desintoxicación de AFB1 y AFG2 se muestran en los suplementos.

Los cálculos de QM se realizan en el marco de la teoría funcional de densidad de Kohn-Sham (KS-DFT)37, empleando el nivel de teoría de intercambio y correlación de Perdew-Burke-Ernzerhof (PBE)38. Los resultados numéricos se extraen con el código BigDFT39, que utiliza wavelets de Daubechies para expresar los orbitales KS. Los pseudopotenciales Hartwigsen-Goedecker-Hutter (HGH)40 se utilizan para eliminar los orbitales en los electrones del núcleo. El uso de conjuntos de base wavelet permite el control sistémico de la precisión resultante. Las condiciones de contorno aisladas se incluyen explícitamente en los cálculos, sin efectos de aliasing de supercélulas, utilizando el Poisson Solver del código41. Para los cálculos presentados en este trabajo se emplea un espaciado de malla de ondículas de 0,37 unidades atómicas. El código realiza cálculos de ΔSCF cargados y las funciones de Fukui (FuF) se definen como la diferencia entre la densidad electrónica del estado fundamental neutro y la cantidad correspondiente en el estado catiónico vertical.

La estructura cristalográfica 3D inicial de la isoforma beta de Trametes versicolor, basada en una estructura del Protein DataBank (código de acceso 1KYA)42, se toma de un trabajo anterior. El modelo de proteína se limpia con el script pdb4amber, parte del paquete de software Amber 2020. Una vez que la estructura pasa la inspección del programa LEAP de Amber, se protona usando el servidor web H++ (versión 3.2)43,44,45 para un pH objetivo de 6.5 para reflejar las condiciones factibles de aplicación en el contexto del proceso de producción de la industria alimentaria. Debido a que H ++ no tiene en cuenta los metales, la estructura protonada resultante se limpia manualmente para voltear los residuos de histidina a fin de mantener la ligadura adecuada de los átomos de cobre incrustados. No se incluyen moléculas de disolvente explícitas en las estructuras finales. Las estructuras 3D de ligandos se generan a partir de ChemDraw 19.1 y se optimizan con Gaussian1646 en fase gaseosa utilizando HF/6-31G*. Las geometrías resultantes se importan en Hermes, un componente de aplicación de CSD-Discovery Suite 2020 que interactúa con GOLD47. Los enlaces se reparan utilizando la limpieza de estructura de Hermes para garantizar la legibilidad por parte de GOLD.

Las estructuras de proteínas protonadas y ajustadas se importan al asistente de configuración de acoplamiento GOLD 2020.2.0. El bolsillo se define usando un átomo de un residuo que recubre la cavidad, y el algoritmo de búsqueda de bolsillo de GOLD se usa para determinar el bolsillo. Se tiene cuidado para garantizar que todos los residuos y los átomos de cobre se reconozcan adecuadamente. Todas las opciones de flexibilidad de ligandos y receptores están habilitadas además de diversas soluciones con un tamaño de grupo de 5 y una desviación cuadrática media (RMSD) de 2 Å. El algoritmo genético está configurado para la máxima eficiencia de búsqueda con configuraciones automáticas para el propio algoritmo. Las poses se califican y vuelven a calificar con CHEMPLP y GoldScore, respectivamente. De las 15 poses principales acopladas de cada toxina, inspeccionamos visualmente y extrajimos cinco poses que representan orientaciones de unión únicas (consulte la Tabla complementaria S1 para conocer los puntajes de acoplamiento).

Las simulaciones de Molecular Dynamics comienzan con cada una de las cinco poses acopladas extraídas para cada una de las toxinas. Las simulaciones se realizan utilizando el marco OpenMM48 con el campo de fuerza FF14SB49 para lacasa y el campo de fuerza abierto nativo SMIRKS50 para cada toxina. Usamos una temperatura de 300 K, más el Integrador Variable Langevin con los coeficientes de convergencia y fricción predeterminados para 20,000,000 pasos (aproximadamente 25 ns). Restringimos las distancias entre los átomos de cobre y los residuos vecinos de histidina (nitrógeno) y cisteína (azufre) entre los cobres tipo 2 y tipo 3, en función de un conjunto de geometrías optimizadas (consulte la siguiente sección). Descartamos las primeras partes de cada simulación usando la heurística de la regla de error estándar marginal con un tamaño de lote de 20051,52, así como las instantáneas donde la aflatoxina sale del bolsillo (B1-6-3, B1-6-4, G2-1 -2, G2-13-1, G2-13-2, G2-13-3). Usando los entornos de incrustación definidos en la siguiente sección como guía, extraemos instantáneas de las simulaciones de MD. Los residuos en el entorno se alinean y se extrae una nueva instantánea cada vez que la desviación cuadrática media entre una instantánea determinada y todas las instantáneas extraídas es superior a 4,0 bohr.

Advertimos que tal protocolo MD es por sí mismo insuficiente para los cálculos de energía libre. Los átomos de cobre y el radical de cisteína de la lacasa son difíciles de modelar y requieren un campo de fuerza especialmente parametrizado, o dinámica QM/MM (ver Refs.53,54 para lacasa). También se requieren tiempos de trayectoria más largos o técnicas de muestreo avanzadas para un muestreo completo del espacio de configuración. Hacemos hincapié en que nuestras simulaciones de MD están destinadas a generar un conjunto diverso de poses plausibles de aflatoxinas para procesarlas posteriormente con cálculos de QM.

Anteriormente describimos un marco de reducción de la complejidad que utiliza la densidad electrónica calculada por los cálculos de QM para representar un sistema completo a partir de los cálculos de solo un subconjunto del sistema55,56. El paso clave en este análisis es el cálculo del orden de enlace de fragmentos (FBO), que es una generalización del orden de enlace atómico a las interacciones entre dos conjuntos arbitrarios de átomos. El FBO, en este caso, se usa para asignar una fuerza de interacción (sin unidades) a los pares de ligandos de aminoácidos. Luego, el FBO se puede usar para generar un entorno de incrustación, definido como el conjunto mínimo de fragmentos tal que la suma de los órdenes de enlace de todos los fragmentos excluidos está por debajo de un umbral establecido en 0,01 para este estudio. La capacidad de descomponer las interacciones proteína-ligando en una contribución por aminoácido es un gran activo de los cálculos de QM a gran escala57.

Para calcular el FBO, realizamos cálculos de DFT en todo el complejo proteína-toxina (casi 7400 átomos) utilizando el modo de escalado lineal de BigDFT58,59,60, con solvente implícito61. Realizamos cálculos tanto en las estructuras acopladas como en las instantáneas de las simulaciones MD. Para las estructuras acopladas, realizamos una optimización inicial para eliminar los conflictos estéricos que dificultan los cálculos de DFT. Primero, las posiciones de los átomos de hidrógeno se optimizan utilizando el campo de fuerza FF14SB. En segundo lugar, cada residuo de la proteína se optimiza utilizando el método de unión estrecha de GFN262, con disolvente implícito. Cada residuo se incrusta en un entorno fijo cubierto de hidrógeno de residuos definidos como aquellos dentro de 4,5 Å, y luego se optimiza. Para los átomos de cobre, se usó una estrategia de incrustación similar, y también se permitió que las histidinas vecinas se movieran. Para optimizar el cúmulo trinuclear, construimos un sistema que contiene los tres cobres y residuos dentro de 4,5 Å de cualquiera de los tres cobres, con todas las histidinas y átomos de cobre en movimiento.

A partir de los cálculos de las estructuras acopladas, usamos el FBO para identificar un conjunto de residuos que interactúan fuertemente con la toxina en al menos una pose: Phe162, Pro163, Leu164, Asp206, Asn264, Phe265, Phe332, Phe337, Pro391, Gly392, Ala393, Pro394, Ile455, His458. Estos aminoácidos se rastrean al extraer instantáneas de la simulación MD. Utilizamos este mismo enfoque FBO para construir modelos de clúster a partir de instantáneas MD extraídas. Identificamos residuos, que interactúan fuertemente con la toxina o el átomo de cobre del sitio activo, para agregarlos al modelo. Además, incluimos cualquier aminoácido de conexión y terminamos los grupos con tapas de amida. El sistema de grupos incluye residuos: Lys157, Pro160, Ala161, Phe162, Pro163, Leu164, Asp206, Pro207, Asn208, Asn264, Phe265, Thr335, Asn336, Phe337, Ala388, Ala389, Ala390, Pro391, Gly392, Ala393, Pro394 , Su395, Thr430, Pro431, Ala432, Cys453, His454, Ile455, Asp456, Phe457, His458, Leu459, Glu460, Ala461.

Las energías de interacción se calculan en el entorno de incrustación definido anteriormente con un enfoque de tres puntos utilizando el PBE funcional con correcciones de dispersión63 y solvente implícito. Un sistema de clúster más pequeño nos permite utilizar el modo de escalado cúbico de BigDFT que puede converger a una mayor precisión que el modo de escalado lineal. Refinamos aún más las energías utilizando el funcional B97M-V junto con el conjunto básico def2-mSVP64, tal como se implementó en Orca65. Recientemente se ha demostrado que el método B97M-V produce energías de enlace precisas entre una enzima y su sustrato para una amplia gama de sistemas66. La corrección de contrapeso geométrico (gCP)67, parametrizada para el conjunto básico def2-mSVP, se aplica para proporcionar una precisión comparable a la del límite del conjunto básico completo. Los cálculos de B97M-V/def2-mSVP se realizaron con efectos de solvatación acuosa incluidos utilizando el modelo CPCM68.

Los códigos fuente para el análisis de la cinética de la reacción están disponibles en GitHub (https://github.com/bmomeni/laccase-aflatoxins-reaction-kinetics). El código BigDFT para realizar cálculos QM y el código PyBigDFT para calcular el FBO están disponibles en el sitio web de BigDFT (https://www.bigdft.org/).

Bennett, JW & Klich, M. Micotoxinas. clin. Microbiol. Rev. 16, 497–516 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Chu, FS Toxicología. En Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (eds Caballero, B. et al.) 4096–4108 (Elsevier Science, 2003).

Capítulo Google Académico

Klingelhofer, D. et al. Aflatoxina: análisis de publicación de una amenaza para la salud mundial. Control de Alimentos 89, 280–290 (2018).

Artículo Google Académico

Lyagin, I. & Efremenko, E. Enzimas para la desintoxicación de varias micotoxinas: orígenes y mecanismos de acción catalítica. Moléculas 24, 2362 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Wu, Q. et al. Degradación biológica de aflatoxinas. Metab de drogas Rev. 41, 1–7 (2009).

Artículo Google Académico

Alberts, JFF, Gelderblom, WCACA, Botha, A. & van Zyl, WHH Degradación de aflatoxina B1 por enzimas lacasa de hongos. En t. J. Food Microbiol. 135, 47–52 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Dellafiora, L., Galaverna, G., Reverberi, M. & Dall'Asta, C. Degradación de aflatoxinas por medio de lacasas de trametes versicolor: An in silico insight. Toxins (Basilea) 9, 17 (2017).

Artículo Google Académico

Scarpari, M. et al. Aflatoxin control in maize by Trametes versicolor. Toxins (Basel). 6, 3426–3437 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Mate, DM & Alcalde, M. Laccase: Un biocatalizador polivalente a la vanguardia de la biotecnología. Microbio. Biotecnología. 10, 1457–1467 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Zaccaria, M. et al. Diseño de un biorremediador: los modelos mecanicistas guían la especialización celular y molecular. actual Opinión Biotecnología. 62, 98–105 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Solomon, EI, Sundaram, UM & Machonkin, TE Multicopper oxidasas y oxigenasas. química Rev. 96, 2563–2605 (1996).

Artículo CAS Google Académico

Alcalde, M. Lacasas: Funciones biológicas, estructura molecular y aplicaciones industriales. En Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications (eds Polain, AJ & MacCabe, AP) 461–478 (Springer, 2007).

Capítulo Google Académico

Wang, X. et al. Degradación de aflatoxina B1 y zearalenona por lacasas bacterianas y fúngicas en presencia de sustancias químicas estructuralmente definidas y mediadores naturales complejos. Toxinas 11, 609 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Guo, Y. et al. CotA lacasa, una nueva aflatoxina oxidasa de Bacillus licheniformis, transforma la aflatoxina B1 en aflatoxina Q1 y epi-aflatoxina Q1. Química alimentaria 325, 126877 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Kumar, V. et al. Avances tecnológicos recientes en el mecanismo, la toxicidad y las perspectivas alimentarias de la degradación de aflatoxinas mediada por enzimas. crítico Rev. ciencia de los alimentos. Nutrición 62, 5395 (2021).

Artículo Google Académico

Liu, Y. et al. Degradación de aflatoxina B1 por una lacasa recombinante de Trametes sp. C30 expresado en Saccharomyces cerevisiae: un estudio de evaluación del mecanismo in vitro e in vivo. Alimentos Res. En t. 145, 110418 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Okwara, PC, Afolabi, IS & Ahuekwe, EF Aplicación de lacasa en la degradación de aflatoxina B1: una revisión. Conferencia de la OIO. Ser. Mate. ciencia Ing. 1107, 012178 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Festa, G., Autore, F., Fraternali, F., Giardina, P. & Sannia, G. Desarrollo de nuevas lacasas por evolución dirigida: Análisis funcional y computacional. Estructura de proteínas. Función Bioinformar. 72, 25–34 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Mate, DM & Alcalde, M. Laccase ingeniería: Del diseño racional a la evolución dirigida. Biotecnología. Adv. 33, 25–40 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Mateljak, I. et al. Aumento del potencial redox, la actividad del mediador redox y la estabilidad en una lacasa fúngica mediante mutagénesis guiada por computadora y evolución dirigida. Catálogo ACS. 9, 4561–4572 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Liu, Y. et al. Estudios de acoplamiento molecular y degradación in vitro de cuatro aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2) por una lacasa recombinante de Saccharomyces cerevisiae. J. ciencia de los alimentos. 85, 1353–1360 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Zhou, Z., Li, R., Ng, TB, Huang, F. & Ye, X. Consideraciones sobre los determinantes de afinidad para la aflatoxina B1 en la cavidad de unión de la lacasa fúngica en base a estudios de verificación in vitro y mutacionales in silico. ecotoxicol. Reinar. seguro 234, 113412 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Bourbonnais, R., Paice, MG, Reid, ID, Lanthier, P. & Yaguchi, M. Oxidación de lignina por isoenzimas de lacasa de trametes versicolor y papel del mediador 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) en la despolimerización de la lignina kraft. aplicación Reinar. Microbiol. 61, 1876–1880 (1995).

Artículo ADS CAS Google Académico

Hakulinen, N. & Rouvinen, J. Estructuras tridimensionales de lacasas. Celúla. mol. Ciencias de la vida 72, 857–868 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Lee, LS, Dunn, JJ, DeLucca, AJ & Ciegler, A. Papel del anillo de lactona de la aflatoxina B1 en la toxicidad y mutagenicidad. Experientia 37, 16–17 (1981).

Artículo CAS Google Académico

Nelson, DL & Cox, MM Lehninger Principios de bioquímica (Macmillan Learning, 2017).

Google Académico

Zeinvand-Lorestani, H. et al. Estudio comparativo de las propiedades prooxidativas y genotoxicidad in vitro inducidas por la aflatoxina B1 y sus productos detoxificantes mediados por lacasas. Chemosphere 135, 1–6 (2015).

Artículo ADS CAS Google Académico

Geerlings, P., De Proft, F. & Langenaeker, W. Teoría funcional de la densidad conceptual. química Rev. 103, 1793–1873 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Lee, LS & Cucullu, AF Conversión de aflatoxina B1 a aflatoxina D1 en harinas de maní y semilla de algodón amoniacal. J. Agric. Química alimentaria 26, 881–884 (1978).

Artículo CAS Google Académico

Motomura, M., Toyomasu, T., Mizuno, K. & Shinozawa, T. Purificación y caracterización de una enzima de degradación de aflatoxina de Pleurotus ostreatus. Microbiol. Res. 158, 237–242 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Christensen, NJ & Kepp, KP Preparando el escenario para la transferencia de electrones: base molecular de la unión de ABTS a cuatro lacasas de Trametes versicolor a pH variable y estado de oxidación de proteínas. J. Mol. Catal. Enzima B. 100, 68–77 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Mehra, R., Muschiol, J., Meyer, AS & Kepp, KP Una explicación estructural-química de la actividad de la lacasa fúngica. ciencia Rep. 8, 1–16 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Awasthi, M., Jasiwal, N., Singh, S., Pandey, VP y Dwivedi, UN Análisis de simulación dinámica y acoplamiento molecular que revelan la catálisis enzimática diferencial por lacasas de plantas y hongos con respecto a la biosíntesis y degradación de lignina. J. Biomol. Estructura. Din. 33, 1835–1849 (2014).

Artículo Google Académico

Martinez-Sotres , C. , Rutiaga-Quiñones , JG , Herrera-Bucio , R. , Gallo , M. & Lopez-Albarran , P. Molecular docking insights into the inhibitor of laccase activity by medicarpin . ciencia de la madera Tecnología Rev. 49, 857–868 (2015).

Artículo Google Académico

Kadam, SK, Tamboli, AS, Sambhare, SB, Jeon, BH & Govindwar, SP Análisis enzimático, estudio estructural y acoplamiento molecular de lacasa y catalasa de B. subtilis SK1 después de la exposición a tintes textiles. Ecol. Informar. 48, 269–280 (2018).

Artículo Google Académico

Zaccai, NR & Coquelle, N. Oportunidades y desafíos en cristalografía de neutrones. Conferencia web EPJ. 236, 02001 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Kohn, W. & Sham, LJ Ecuaciones autoconsistentes que incluyen efectos de intercambio y correlación. física Rev. 140, A1133–A1138 (1965).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Perdew, JP, Burke, K. & Ernzerhof, M. Aproximación de gradiente generalizada simplificada. física Rev. Lett. 77, 3865–3868 (1996).

Artículo ADS CAS Google Académico

Ratcliff, LE et al. Flexibilidades de wavelets como base computacional establecida para cálculos de estructuras electrónicas a gran escala. J. Chem. física 152, 194110 (2020).

Artículo ADS CAS Google Académico

Willand, A. et al. Pseudopotenciales conservadores de normas con precisión química en comparación con los cálculos de todos los electrones. J. Chem. física 138, 104109 (2013).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Cerioni, A., Genovese, L., Mirone, A. & Sole, VA Solucionador eficiente y preciso de la ecuación de Poisson tridimensional apantallada y no apantallada con condiciones de contorno genéricas. J. Chem. física 137, 134108 (2012).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Bertrand, T. et al. Estructura cristalina de una lacasa de cuatro cobres complejada con una arilamina: conocimientos sobre el reconocimiento de sustratos y correlación con la cinética. Bioquímica 41, 7325–7333 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Anandakrishnan, R., Aguilar, B. & Onufriev, AV H++ 3.0: Automatización de la predicción de pK y la preparación de estructuras biomoleculares para modelos y simulaciones moleculares atomísticas. Ácidos Nucleicos Res. 40, 537 (2012).

Artículo Google Académico

Myers, J., Grothaus, G., Narayanan, S. & Onufriev, A. Un algoritmo de agrupamiento simple puede ser lo suficientemente preciso para su uso en los cálculos de pKs en macromoléculas. Estructura de proteínas. Función Gineta. 63, 928–938 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Gordon, JC et al. H ++: un servidor para estimar pKas y agregar hidrógenos faltantes a macromoléculas. Ácidos Nucleicos Res. 33, 368 (2005).

Artículo Google Académico

Frisch, MJ et al. Gaussian 16 Revisión A.03 (2016).

Jones, G., Willett, P., Glen, RC, Leach, AR & Taylor, R. Desarrollo y validación de un algoritmo genético para acoplamiento flexible. J. Mol. Biol. 267, 727–748 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Eastman, P. et al. OpenMM 7: desarrollo rápido de algoritmos de alto rendimiento para dinámica molecular. Cómputo PLoS. Biol. 13, e1005659 (2017).

Artículo Google Académico

Maier, JA et al. ff14SB: mejora de la precisión de los parámetros de cadena lateral y columna vertebral de proteínas de ff99SB. J. Chem. Cálculo de la teoría. 11, 3696–3713 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Mobley, DL et al. Escape de tipos de átomos en campos de fuerza usando percepción química directa. J. Chem. Cálculo de la teoría. 14, 6076–6092 (2018).

Artículo CAS Google Académico

White, KP Una heurística de truncamiento eficaz para la reducción del sesgo en la salida de la simulación. Simulación 69, 323–334 (2016).

Artículo Google Académico

Dawson, W. & Gygi, F. Equilibración y análisis de simulaciones de agua de dinámica molecular de primeros principios. J. Chem. física 148, 124501 (2018).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Santiago, G. et al. Ingeniería de lacasa asistida por computadora: Hacia la oxidación biológica de arilaminas. Catálogo ACS. 6, 5415–5423 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Monza, E. et al. Conocimientos sobre la ingeniería de lacasa a partir de simulaciones moleculares: hacia una estrategia centrada en la unión. J. física. química Letón. 6, 1447–1453 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Mohr, S., Masella, M., Ratcliff, LE y Genovese, L. Reducción de la complejidad en grandes sistemas cuánticos: identificación de fragmentos y análisis de población a través de una base mínima local optimizada. J. Chem. Cálculo de la teoría. 13, 4079–4088 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Dawson, W., Mohr, S., Ratcliff, LE, Nakajima, T. y Genovese, L. Reducción de la complejidad en los cálculos de la teoría funcional de la densidad de grandes sistemas: partición del sistema e incrustación de fragmentos. J. Chem. Cálculo de la teoría. 16, 2952–2964 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Dawson, W. et al. Cálculos de la teoría funcional de la densidad de grandes sistemas: interacción entre fragmentos, observables y complejidad computacional. Wiley Interdiscip. Cómputo Rev. mol. ciencia 12, e1574 (2021).

Google Académico

Mohr, S. et al. Wavelets de Daubechies para la teoría funcional de densidad de escala lineal. J. Chem. física 140, 204110 (2014).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Mohr, S. et al. Cálculos DFT de escala lineal precisos y eficientes con aplicabilidad universal. física química química física 17, 31360–31370 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Mohr, S. et al. Cálculo eficiente de funciones matriciales dispersas para cálculos de estructuras electrónicas a gran escala: la biblioteca CheSS. J. Chem. Cálculo de la teoría. 13, 4684–4698 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Fisicaro, G., Genovese, L., Andreussi, O., Marzari, N. y Goedecker, S. Un solucionador generalizado de Poisson y Poisson-Boltzmann para entornos electrostáticos. J. Chem. física 144, 014103 (2016).

Artículo ADS CAS Google Académico

Bannwarth, C., Ehlert, S. y Grimme, S. GFN2-xTB: un método químico cuántico de enlace estrecho autoconsistente preciso y ampliamente parametrizado con electrostática multipolar y contribuciones de dispersión dependientes de la densidad. J. Chem. Cálculo de la teoría. 15, 1652–1671 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Grimme, S. Funcional de densidad de tipo GGA semiempírico construido con una corrección de dispersión de largo alcance. J. Cómputo. química 27, 1787-1799 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Grimme, S., Brandenburg, JG, Bannwarth, C. & Hansen, A. Estructuras e interacciones consistentes por la teoría funcional de la densidad con pequeños conjuntos de bases orbitales atómicas. J. Chem. física 143, 054107 (2015).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Neese, F. Actualización de software: El sistema del programa ORCA—Versión 5.0. Wiley Interdiscip. Cómputo Rev. mol. ciencia 12, 1606 (2022).

Artículo Google Académico

Chan, B., Dawson, W. & Nakajima, T. Buscando un funcional de densidad fiable para las interacciones entre la molécula y el entorno, se encontró B97M-V/def2-mTZVP. J. física. química A 126, 2397–2406 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Kruse, H. & Grimme, S. Una corrección geométrica para la base intermolecular e intramolecular establece el error de superposición en Hartree-Fock y los cálculos de la teoría funcional de la densidad para sistemas grandes. J. Chem. física 136, 154101 (2012).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Barone, V. & Cossi, M. Cálculo cuántico de energías moleculares y gradientes de energía en solución mediante un modelo de solvente conductor. J. física. química A 102, 1995–2001 (1998).

Artículo CAS Google Académico

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Los autores agradecen a Laura Ratcliff, Claudia Mondelli y Nicolas Coquelle por sus útiles debates. BM y MZ recibieron el apoyo de un fondo de puesta en marcha y una subvención interna Ignite de Boston College, un premio a la excelencia en investigación biomédica de la Smith Family Foundation y un NSF-Env. Premio de ingeniería (NSF#2103545). Agradecemos al Boston College Mass Spectroscopy Core por su infraestructura y apoyo. Este trabajo fue apoyado por el proyecto Supercomputadora de Próxima Generación (la computadora K) y el proyecto FLAGSHIP2020 (Supercomputadora Fugaku) dentro del estudio prioritario 5 (Desarrollo de nuevas tecnologías fundamentales para la creación, conversión/almacenamiento y uso de energía de alta eficiencia) de la Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón. Los experimentos presentados en este documento se llevaron a cabo utilizando el banco de pruebas Grid'5000, respaldado por un grupo de interés científico organizado por Inria y que incluye CNRS, RENATER y varias universidades, así como otras organizaciones (ver https://www.grid5000.fr). Se realizaron cálculos adicionales utilizando el sistema de supercomputadora Hokusai en RIKEN. Este trabajo fue apoyado en parte por la Oficina del Gabinete, Gobierno de Japón, Programa de Promoción de Innovación Estratégica Interministerial (SIP), "Tecnologías para la Bioindustria y Agricultura Inteligentes" (agencia de financiación: Institución de Avance de Investigación de Tecnología Bioorientada, NARO). LG también reconoce el apoyo del Centro Europeo de Excelencia MaX (proyecto ID 676598).

Estos autores contribuyeron por igual: Marco Zaccaria y William Dawson.

Departamento de Biología, Boston College, Chestnut Hill, MA, 02467, EE. UU.

Marco Zaccaria, Darius Russell Kish y Babak Momeni

Centro RIKEN para la ciencia computacional, Kobe, 6500047, Japón

William Dawson, Bun Chan y Takahito Nakajima

Departamento de Biología Ambiental y Evolutiva, Universidad "Sapienza" de Roma, 00185, Roma, Italia

Massimo Reverberi

Departamento de Ciencias Bioquímicas "Alessandro Rossi Fanelli", Universidad "Sapienza" de Roma, 00185, Roma, Italia

María Carmela Bonaccorsi de Patti

Departamento de Química, Boston College, Chestnut Hill, MA, 02467, EE. UU.

marek domina

Institut Laue-Langevin, 38042, Grenoble, Francia

Viviana Cristiglio

Escuela de Graduados de Ingeniería, Universidad de Nagasaki, Nagasaki, 8528521, Japón

hola chan

Departamento de Alimentos y Medicamentos, Universidad de Parma, 43124, Parma, Italia

Luca Dellafiora

CEA/CNRS/IBS, Universidad Grenoble Alpes, 38044, Grenoble, Francia

Tenedor franco

CEA/INAC-MEM/L-Sim, Universidad Grenoble Alpes, 38044, Grenoble, Francia

Luis genovés

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Concepción: MZ, WD, MR, VC, FG, LD, LG, BM Experimentos: MZ, MD Computacionales: WD, DK, BC, LD, TN, LG Análisis: MZ, WD, BC, MR, FG, MP, VC , LG, BM Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Babak Momeni.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zaccaria, M., Dawson, W., Russel Kish, D. et al. Estudio teórico-experimental de la lacasa como desintoxicante de aflatoxinas. Informe científico 13, 860 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27519-1

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Recibido: 18 Agosto 2022

Aceptado: 03 enero 2023

Publicado: 17 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27519-1

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